High throughput DNA barcoding to assess the diversity of Laurentian insects

La grande diversité d’insectes et la quantité de spécimens recueillis lors de l’échantillonnage constituent les plus grands défis de la systématique des insectes. Le tri des échantillons au niveau des espèces est nécessaire avant qu’ils puissent être utilisés pour des enquêtes sur les modèles de biodiversité. En raison de l’obstacle taxonomique, le manque d’expertise taxonomique, de nombreuses études sur la diversité des insectes classe les spécimens en Unités Morphologiques Opérationnelles (MorphOTUs), aussi appelées morpho-espèces, en désignant les groupes définis subjectivement en fonction de caractéristiques morphologiques évidentes. Cependant, il est long et douteux de définir avec précision les limites des espèces en se fondant sur les MorphOTUs, surtout dans les groupes où il y a de minuscules insectes et une grande similarité au niveau des espèces, comme chez les Hyménoptères. Le codage à barres de l’ADN, une approche taxonomique discriminatoire qui utilise des séquences d’ADN, a accéléré la classification taxonomique et peut être une approche alternative aux MorphOTUs. Cependant, il est crucial d’utiliser une stratégie fiable et économique de codage à barres ADN pour traiter un grand nombre d’échantillons. En outre, le codage à barres d’ADN devrait fonctionner avec les espèces problématiques dans l’entomologie moléculaire comme on l'observe parfois avec les hyménoptères. Afin de mettre en œuvre une évaluation rapide de la biodiversité des Hyménoptères, optimiser les de étapes de barcodage d`ADN (extraction d’ADN, amplification par PCR et séquençage) était le premier objectif de ce projet de recherche. On a testé et optimisé une extraction d’ADN arrivant à une méthode coûtante 0,20 dollars par spécimen. On a validé la performance adéquate des mini-codes à barres d’ADN, réduits en taille à 313bp, pour établir une classification d’Unités Taxonomiques Opérationnelles Moléculaires (MOTUs) comparable à celle du codage à barres d’ADN couramment utilisé, de longueur de 658bp. On a adopté ce protocole optimisé pour le codage à barres de 517 spécimens d’Hyménoptères échantillonnés par des pièges aspirateurs situés dans la forêt laurentienne de l’Est du Canada. Avec le séquençage multiplexé à haut débit Illumina, impliquant des amplicons étiquetés, on a obtenu des mini-codes à barres pour 88% des spécimens. Le coût et le temps nécessaires pour générer des données MOTU, grâce à notre approche de codage à barres d’ADN, étaient environ la moitié de celui de la classification morphologique en MorphOTUs. Le deuxième objectif de ma recherche était de comparer l’efficacité du tri morphologique des MorphOTUs avec l’identification moléculaire et la délimitation par MOTUs. On a démontré iii une forte congruence entre l’identification morphologique et moléculaire au niveau taxonomique de la famille dansla base de données Barcode of Life (BOLD) et GenBank (93 %), alors que seulement 18 % des mini-codes à barres ont été attribués à des identifications plus précises (genre ou espèce). La délimitation moléculaire s’est faite avec quatre méthodes de regroupement différentes (basée sur la distance : Découverte automatique de l’écart de codes à barres (ABGD) et Assemblage des espèces par partitionnement automatique (ASAP) ; basée sur un dendrogramme : Coalescente mixte généralisée du yule (GMYC) et Processus bayésien de l’arbre de poisson (bPTP)). En générale, les méthodes moléculaires ont plus que doublé la diversité estimée des MorphOTUs des Hyménoptères. Les MOTUs étaient en grande partie incompatibles avec les MorphOTUs (ratio d’appariement <0,35). Les méthodes basées sur la distance ont donné des résultats plus conformes au tri morphologique que les méthodes basées sur les arbres, en particulier dans la superfamille des Chalcidoidea. Compte tenu de la comparaison entre le coût et le temps des méthodes de classification moléculaire et morphologique, nos résultats suggèrent que le codage à barres mini-ADN pour estimer la diversité des espèces d’Hyménoptères est plus économique que le tri par MorphOTU. Cependant, bien que les méthodes MorphOTU et MOTU aient donné de nombres unités taxonomiques différentes, les analyses de la diversité utilisées actuellement tiennent compte de l’abondance et d’autres paramètres. On n’a pas évalué si les MorphOTUs et les protocoles d’entente donneraient des résultats suffisamment équivalents dans la recherche réelle sur les diversités α et β, c’est-à-dire pour évaluer s’ils pouvaient tout de même tous deux être utiles.The great insect diversity and the quantity of insect specimens collected during sampling constitute the biggest challenges facing insect systematics. Sorting samples to the species level is necessary before they can be used for investigations of biodiversity patterns. Because of the Taxonomic impediment, the lack of taxonomic expertise, many insect diversity studies sort specimens to Morphological Operational Taxonomic Units (MorphOTUs), also known as morphospecies, classifying subjectively defined groups based on obvious morphological features. However, accurately defining species boundaries based on MorphOTUs is time consuming and questionable, especially in groups with tiny insects and great species-level similarity such as Hymenoptera. DNA barcoding, a taxonomic discriminatory approach that employs DNA sequences, has accelerated taxonomic classification and may be an alternative approach to MorphOTUs. However, it is crucial to use a reliable and economic DNA barcoding strategy to deal with a large number of samples. Additionally, DNA barcoding should work with species problematic in molecular entomology as is sometimes observed with Hymenoptera. In order to implement a rapid biodiversity assessment of Hymenoptera, optimizing the DNA barcoding steps (DNA extraction, PCR amplification, and DNA sequencing) was the first objective of this present research. We tested and optimized a DNA extraction arriving at a method costing 0.20CAD per specimen. We validated the adequate performance of 313bp mini barcodes for establishing Molecular Operational Taxonomic Units (MOTUs) classification, comparable to that of the commonly used full-length DNA barcode of 658bp. We adopted this optimized protocol to barcode 517 Hymenoptera specimens sampled with suction traps located in the Laurentian Forest of eastern Canada. With multiplexed Illumina high throughput sequencing of tagged amplicons, we obtained mini-barcodes for 88% of specimens. The cost and time taken to generate MOTU data through our DNA barcoding approach was approximately twice that of morphological identification for MorphOTU designation. The second objective of my research was to compare the efficacy of morphological sorting of MorphOTUs with the molecular identification and delimitation of MOTUs. We found a high taxonomic congruence between morphological and molecular identification at family level in Barcode of Life (BOLD) and GenBank databases (93%), whereas only 18% of mini-barcode data was assigned to more precise identification (genus or species). Molecular delimitation based on four different clustering methods (distance-based: Automatic Barcode Gap Discovery v (ABGD) and Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP); tree-based: Generalized Mixed Yule Coalescent (GMYC) and Bayesian Poisson Tree Processes (bPTP)) resulted in more than doubling the estimated diversity of Hymenoptera as compared to MorphOTUs. The MOTUs were largely incongruent with MorphOTUs (match ratio <0.35). Distance-based methods gave results more congruent with morphological sorting than tree-based methods, especially within the Chalcidoidea superfamily. Taking into account the comparison between the cost and time of molecular and morphological classification methods, our results suggest that mini-DNA barcoding to estimate a proxy for Hymenoptera species diversity is more economical than MorphOTU sorting. However, although MorphOTU and MOTU methods gave different numbers of species, actual diversity analyses take into account abundance and other parameters. We did not evaluate whether MorphOTUs and MOTUs would yield sufficiently equivalent results in actual α- and β diversity research: that is, they may yet both be fit for purpos